Chip/Co-IP/Chip-seq的準備工作：
預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子(用保鮮膜包好后，埋冰下)，離心機
1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次，后一次吸干PBS;
2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞、10cm培養皿或150cm2培養瓶，0.5ml/5×106個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶)
3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15min(EP管插冰上，置水平搖床上)
4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉移到一個新的離心管中
5. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠(50%)，4℃搖晃10min(EP管插冰上，置水平搖床上)，以去除非特異性雜蛋白，降低背景
7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月)
9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高(如10 μg/μl)
10. 加入體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異
11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育
12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體"(兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG)
13. 14000rpm瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合，可以使用PBS
14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定(60 μl足夠上三道)
15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應再次煮5min變性。
更新時間：2023-03-07
點擊次數：3180
當前位置：
